Quelle

Zeitschrift für Hygiene und Infectionskrankheiten

herausgegeben von Dr. R. Koch (Geh. Medicinalrath und Director des Institutes für Infections-Krankheiten zu Berlin), und Dr. C. Flügge (O. Ö. Professor und Director des Hygienischen Institutes der Universität Breslau),

Vierzehnter Band.

Mit zahlreichen Abbildungen im Text und fünf Tafeln.

Leipzig, Verlag von Veit & Comp. 1693.

Ueber einige Fehlerquellen bei Anstellung der Cholerarothreaction und ihre Vermeidung. [1]

Von Dr. Max Bleisch,

Königl. Kreis-Physikus, Cosel O./Schl.

Während der im XIII. Bande dieser Zeitschrift Hft. 1, S. 31 ff. geschilderten Untersuchungen wollte es mir trotz vielfacher Bemühungen nicht gelingen, die Cholerarothreaction an einer der vorjährigen Choleraepidemie entstammenden Choleracultur hervorzurufen.

Ich war zunächst geneigt, das Ausbleiben der Reaction für eine Eigenthümlichkeit der in meinen Händen befindlichen Cultur zu halten, zumal zu gleicher Zeit Prof. Fränkel [2] in Marburg an einer anderen frischen Cultur gemachte, anscheinend analoge Beobachtungen veröffentlichte.

Wie er die Güte hatte, mir mitzutheilen, liessen seine Beobachtungen nach dem Ausfall der angestellten Controlversuche eine andere Erklärung nicht zu. Immerhin war ich meiner Sache, so weit meine Cultur in Betracht kam, nicht ganz sicher, weil ich im Oppelner Laboratorium an allerdings alten Gelatineculturen derselben Herkunft das Eintreten der Reaction selbst beobachtet hatte. In der That trat die Reaction sofort ein, als ich statt der zur Züchtung bis dahin benutzten, von früher her vorräthigen Fleischpeptonbouillon eine neu angefertigte benützte. Weitere Controlversuche machten es in hohem Grade wahrscheinlich, dass der Grund des Ausbleibens der Reaction in der Beschaffenheit der ursprünglich benutzen Bouillon zu suchen war. Ich füge hinzu, dass in beiden Brühen, die übrigens beide genau nach derselben Vorschrift angefertigt waren, das Wachsthum gleich gut vor sich ging.

Meine nächste Vermuthung, dass der Grund des Ausbleibens bezw. Eintrittes der Reaction in einer thatsächlich vorhandenen Verschiedenheit der Alkalescenz der benutzten Nährböden zu suchen sei, wurde dadurch widerlegt, dass eine innerhalb der äussersten Wachsthumsgrenzen vorgenommene Abstufung der Alkalescenz beider Brühen ohne Einfluss auf den Eintritt bezw. das Ausbleiben der Reaction blieb. Es waren deshalb nur noch zwei Möglichkeiten gegeben; entweder fehlte in der die Reaction nicht gebenden Brühe ein zur Hervorbringung der ersteren nothwendiger Stoff oder es war in derselben ein die Reaction hindernder Stoff vorhanden. Der diagnostische Werth der Cholerarothreaction liess es mir lohnend erscheinen, dem Grunde des Ausbleibens derselben in meinem Falle weiter nachzuspüren. Die Resultate meiner Untersuchungen glaube ich, deshalb veröffentlichen zu dürfen, weil sie meiner Ansicht nach geeignet sind, zur Vermeidung gewisser Fehlerquellen zu dienen, die sonst den diagnostischen Werth der Cholerarothreaction beeinträchtigen müssen.

Der Gang meiner Untersuchungen wurde durch folgende Erwägungen bestimmt:

Bekanntlich hat Salkowski [3] nachgewiesen, dass "die Cholerarothreaction nichts anderes, wie eine ganz gewöhnliche Indolreaction ist" und die Erklärung dafür darin gefunden, dass "die Cholerabacillen constant neben Indol (im Gegensatz zu anderen Bakterien) salpetrige Säure produciren, welche sich als Nitrit in der Flüssigkeit befindet." Abweichend von Salkowski [4], welcher die zur Hervorbringung der Reaction nothwendigen Nitrite für Oxydationsproducte der Cholerabacillen, entstanden aus abgespaltenem Ammoniak, hielt, zeigte Petri [5], dass "die rothe Cholerareaction unter Vermittelung von Verunreinigungen der zur Herstellung der Nährböden verwendeten Substanzen (besonders Gelatine und Kochsalz) und zwar durch Reduction der in ihnen enthaltenen Nitrate zu Nitriten zu Stande kommt." Eine Oxydation von abgespaltenem Ammoniak durch die Lebensthätigkeit der Cholerabakterien hält er, wie ich hinzufüge, für noch unerwiesen und auch für unwahrscheinlich. Nach Nencki und Salkowski [6] endlich ist das Zustandekommen der Reaction von einem gewissen Procentgehalt an Indol einerseits, an Nitriten andererseits abhängig: "Versetzt man 10 ccm einer Indollösung von 0,03 bis 0,05 pro mille Gehalt mit 1 ccm einer Lösung von käuflichem, reinen Kaliumnitrit, die 0,02 in 100 ccm enthält, so giebt eine solche Lösung mit reiner concentrirter Schwefelsäure die prächtigste "Cholerareaction". Geht man mit dem Zusatz von Kaliumnitrit erheblich über die angegebene Quantität hinaus, so tritt entweder sofort Gelbfärbung ein unter Bildung von Nitroproducten -- vermuthlich Nitrophenol -- oder die Violettfärbung ist sehr vorübergehend, mitunter nur an einer bestimmten Zone bemerkbar."

Hiernach konnte ich den Fehler meiner Bouillon kaum anderswo, als in einem zu hohen oder in einem zu geringen Gehalt an reducirbaren Nitraten vermuthen, zumal, nachdem ich durch einige Versuche festgestellt hatte, dass Peptonzusatz bis zu 3 Procent dem Uebel nicht abhalf, andererseits den Eintritt der Reaction in der dieselbe gebenden Bouillon nicht hinderte.

Die Untersuchung beider Brühen mittels Diphenylaminschwefelsäure, bezw. Metaphenylendiamin nach der von Petri [7] angegebenen Methode ergab für die die Cholerareaction nicht gebende Brühe nur mit dem ersten Reagens, für die andere Brühe dagegen mit beiden Reagentien ein positives Resultat. Die erste Brühe enthielt demnach zweifellos nur Nitrate, die zweite dagegen Nitrite und (in Rücksicht auf die Zweideutigkeit der Diphenylaminreaction) möglicherweise auch Nitrate. Lag nun der Fehler meiner Bouillon in einem zu niedrigen Gehalt an reducirbaren Nitraten, so musste derselbe durch einen entsprechenden Zusatz von Nitraten ausgeglichen werden können.

In Rücksicht auf die von Salkowski für Nitrite angegebenen sehr engen Grenzwerthe, innerhalb deren bei gewissem Indolgehalt die Reaction zu Stande kommt, war es geboten, vor Anstellung weiterer Versuche diese Grenzwerthe auch für die zu reducirenden Nitrate zu vermitteln. Peptonhaltige Fleischbrühe erschien mir für diesen Zweck ungeeignet, weil diese, wie ich im Gegensatz zu Petri [8] ermittelte, nicht selten, bevor sie noch irgend welchen Zusatz erhält, Nitrate, oder wenn länger gelegenes Fleisch zu ihrer Herstellung benutzt wird, Nitrite in schwankender Menge enthält. Ich benutzte deshalb Peptonlösungen, die aus nitrat- [9] und nitritfreiem Pepton hergestellt worden waren, welches ich auf den gütigen Rath des Hrn. Prof. Carl Fränkel von Witte in Rostock bezogen hatte. Dieses alkalisch reagirende Pepton ist ein anscheinend ausserordentlich reines Präparat, wie aus seiner grossen Löslichkeit in hoher Concentration und besonders daraus hervorgeht, dass dasselbe zu Culturzwecken nur durch Zusatz von ½ Proc. Kochsalz geeignet gemacht werden kann. Aber auch 1 proc. Lösungen, mit ½ Procent Kochsalz versehen, waren zu schwach, um ein nennenswerthes Wachsthum der eingesäten Cholerabacillen aufkommen zu lassen; einigermassen besser, aber noch immer unvollkommen, wurde dasselbe durch einen geringen Zusatz von Kalinitrat; dagegen erwiesen sich 2 procentige Lösungen mit ½ Proc. Kochsalzzusatz als durchaus geeignet. Das als Zusatz benutzte Kochsalz war ebenso, wie das benutzte Kalinitrat von Riedel - Berlin bezogen; das erstere war frei von Nitraten und Nitriten, das letztere frei von Nitriten.

Ich stellte mir nun zunächst, um Material und Zeit zu sparen, und um die beabsichtigte Zusammensetzung der zu construirenden Culturflüssigkeiten möglichst gleichmässig zu erreichen, folgende Urlösungen her, welche vor ihrer Verwendung filtrirt und sterilisirt worden waren:

  1. Peptonlösung: 20 grm reines Pepton zu 80 grm destillirten Wassers
    (10 Tropfen Lösung = 0,1 grm Pepton).
  2. Kochsalzlösung: 20 grm reines Kochsalz zu 80 grm destillirten Wassers
    (5 Tropfen Lösung = 0,05 grm Kochsalz).
  3. Kalinitratlösung: 0,08 grm Kalinitrat zu 100 grm destillirten Wassers
    (5 Tropfen Lösung = 0,0002 grm Kalinitrat).

Aus diesen, wie ich mich nochmals überzeugte, von Nitraten und Nitriten, bezw. (Lösung 3) von Nitriten freien Lösungen stellte ich nach einigen Vorversuchen mittels des Pipettenverfahrens folgende Nährflüssigkeiten im Reagensglase her (s. S. 107).

Die durchweg in doppelter Anzahl angefertigten Reagensgläschen gelangten nach ihrer Sterilisirung, und nachdem sie aus einer Aufschwemmung von Cholerabacillen in Reincultur mit je 1 Tropfen der Aufschwemmung beschickt worden waren, auf 24 Stunden in den Brütschrank bei 37° C.

Nach Ablauf dieser Zeit wurden sie dem Brütschrank zur Vornahme der Cholerarothreaction und der Reaction mittels Metaphenylendiamin und Essigsäure auf Nitrite entnommen; dabei wurde je eine Hälfte jedes Gläschens mittels Metaphenylendiamin einerseits, mittels reiner Schwefelsäure andererseits geprüft.

Das Ergebniss war folgendes:

  1. Die Cholerabacillen hatten sich in allen Gläschen reichlich vermehrt; nur in den beiden Gläschen Nr. 1, welche lediglich Pepton enthielten, war das Wachsthum ausgeblieben.
  2. Sämmtliche Gläschen mit Ausnahme der Gläschen Nr. 1, in welchen ein Wachsthum nicht erfolgt war, zeigten die Nitritreaction, und zwar in einem in der Reihenfolge von 2 nach 16 zunehmenden Grade.

    1. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + 9 grm dest. Wasser    
    2. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + 9 grm dest. Wasser    
    3. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0004% (1 Tr. Lös. 3) + 8 ¾ grm dest. W.
    4. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0008% (2 Tr. Lös. 3) + 8 ¾ grm dest. W.
    5. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0012% (3 Tr. Lös. 3) + 8 ¾ grm dest. W.
    6. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0016% (4 Tr. Lös. 3) + 8 ¾ grm dest. W.
    7. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,002% (5 Tr. Lös. 3) + 8 ½ grm dest. W.
    8. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0024% (6 Tr. Lös. 3) + 8 ½ grm dest. W.
    9. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0028% (7 Tr. Lös. 3) + 8 ½ grm dest. W.
    10. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0032% (8 Tr. Lös. 3) + 8 ½ grm dest. W.
    11. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,0036% (9 Tr. Lös. 3) + 8 ½ grm dest. W.
    12. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,004% (10 Tr. Lös. 3) + 8 ¼ grm dest. W.
    13. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,006% (15 Tr. Lös. 3) + 8 grm dest. W.
    14. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,008% (20 Tr. Lös. 3) + 7 ¾ grm dest. W.
    15. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,01% (25 Tr. Lös. 3) + 7 ½ grm dest. W.
    16. Pepton 2% (20 Tr., Lös. Nr. 1) + Kochsalz ½ % (5 Tr. Lös. 2) + Kal. nitrat 0,012% (30 Tr. Lös. 3) + 7 ¼ grm dest. W.
    Auch in dem Gläschen Nr. 2, dessen Componenten selbst bei starker Concentration mit Diphenylaminschwefelsäure keine Nitratreaction gegeben hatten, war die Reaction, wenn auch nur schwach, eingetreten. [10]
  3. Die Cholerarothreaction trat auf Zufügen von einigen Tropfen concentrirter reiner Schwefelsäure nur ein in den Gläschen Nr. 3 bis incl. 12, welche also einen Nitratgehalt von 0,0004 bis 0,004 Procent aufwiesen. Am schönsten zeigte sie sich in den Gläschen 5 und 6 (0,0012 und 0,0016 Procent Nitratgehalt) leidlich gut in den Gläschen 4, 7, 8, 9 und 10, angedeutet nur in den Gläschen 3, 11 und 12. In Gläschen 2 war sie nur nach Zusatz von wenigen Tropfen einer 0,08 Proc. Natriumnitrit auf 100 grm Wasser enthaltenden Lösung zu erzielen.

Hiernach lagen die äussersten Grenzwerthe, innerhalb deren ich zu meiner Bouillon Nitrate zusetzen durfte, um dieselbe reactionsfähig zu machen, falls ein mehr oder weniger grosser Nitratmangel das Ausbleiben der Reaction verschuldete, zwischen 1 und 8 Tropfen meiner Kalinitratlösung auf ca. 10 ccm Bouillon (= 0,0004 bis 0,0032 Procent Kalinitrat).

Ich füllte deshalb 8 Gläschenpaare mit je 10 ccm der fraglichen Bouillon, setzte dazu aufsteigend 1 bis 8 Tropfen meiner Kalinitratlösung, sterilisirte und inficirte diese Gläschen, sowie ein 17. Controlgläschen, welches mit einer die Reaction gebenden nitrathaltigen Pepton-Kochsalzlösung beschickt worden war, in der früher angegebenen Weise mittels je 1 Tropfen Choleraaufschwemmung. Trotz 48 stündigen Stehens der Gläschen im Brütschrank und reichlichen Wachsthums unter entsprechender Nitritbildung liess sich die Reaction indess nur in dem Controlgläschen hervorrufen. Hiermit war bewiesen, dass Nitratmangel nicht der Grand des Ausbleibens der Reaction in meiner Bouillon sein konnte.

Der Nachweis, dass ein Ueberschuss an Nitraten das Ausbleiben der Reaction verschuldete, konnte in einfacher Weise nur durch Verdünnung der fraglichen Bouillon und damit der in ihr enthaltenen Nitrate geführt werden. Zur Verdünnung benutzte ich, um den ursprünglichen Pepton- und Kochsalzgehalt möglichst wenig zu stören, eine nitrat- und nitritfreie 1 procentige Peptonlösung, welcher nitrat- und nitritfreies Kochsalz zu ½ Procent zugesetzt worden war.

Als Controlflüssigkeiten dienten eine 1 bezw. 2 procentige Peptonlösung mit und ohne Zusatz von Kochsalz, bezw. Kalinitricum innerhalb der ermittelten Grenzwerthe, sowie die fragliche Brühe, deren Pepton- und Kochsalzgehalt um 1 bezw. ½ Procent erhöht worden war. Zur Herstellung aller benutzten Nährflüssigkeiten wurden, wie ich hinzufüge, die S. 106 angeführten Urlösungen verwendet.

Die zu dem Versuche benutzten Flüssigkeiten waren folgende:

1. Pepton 1 Procent,  
2. Pepton 1 Procent, Kochsalz ½ Procent,
3. Pepton 1 Procent, Kochsalz ½ Procent, Kali nitricum 0,0012 Procent,
4. Pepton 2 Procent,  
5. Pepton 2 Procent, Kochsalz ½ Procent,
6. Pepton 2 Procent, Kochsalz ½ Procent, Kali nitricum 0,0012 Procent,
7. Bouillon; Pepton 1 Procent, Kochsalz ½ Procent,
8. Bouillon 1 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 9 grm
9. Bouillon 2 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 8 grm
10. Bouillon 3 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 7 grm
11. Bouillon 4 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 6 grm
12. Bouillon 5 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 5 grm
13. Bouillon 6 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 4 grm
14. Bouillon 7 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 3 grm
15. Bouillon 8 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 2 grm
16. Bouillon 9 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 1 grm
17. Bouillon 10 grm, Peptonkochsalzlös. (1 Proc. Pept., ½ Proc. Kochsalz) 0 grm

Von jeder Lösung wurden zwei sterilisirte Reagensgläschen beschickt, und nach abermaliger Sterilisation in der früher geschilderten Weise inficirt; die Gläschen gelangten darauf sämmtlich auf 24 Stunden in den auf 37° C. eingestellten Brutschrank.

Das Ergebniss der hierauf vorgenommenen Prüfung war folgendes:

  1. Eine nennenswerthe Vermehrung der Cholerabacillen hatte in allen Gläschen stattgefunden mit Ausnahme der Gläschen 1, 2 und 4, welche entweder nur Pepton oder neben 1 Proc. Pepton nur Kochsalz enthielten. Auch in Gläschen 3, welches, neben 1 Proc. Pepton, ½ Proc. Kochsalz und 0,0012 Proc. Kalinitrat enthielt, war das Wachsthum ein nur sehr spärliches.
  2. Von den Controlgläschen (1 bis 7) zeigten nur diejenigen eine deutliche Nitritreaction, in welchen ein nennenswerthes Wachsthum erfolgt war, nämlich 3 und 5 bis 7, am stärksten Gläschen 6 und 7, von welchen das erstere keine Bouillon, wohl aber Kali nitricum innerhalb der ermittelten Grenzwerthe, das zweite dagegen Bouillon enthielt. Die übrigen sämmtlich bouillonhaltigen Gläschen zeigten die Nitritreaction in einem im geraden Verhältniss mit dem Bouillongehalte zunehmenden Maasse.
  3. Die Cholerarothreaction trat deutlich nur ein in dem Controlgläschen Nr. 6, welches zwar keine Bouillon, wohl aber Kali nitricum innerhalb der ermittelten Grenzwerthe enthielt und ferner in den bouillonhaltigen Gläschen 8 bis einschliesslich 12; sehr gut und am stärksten war sie in Gläschen 8 ausgeprägt, um von da ab constant an Stärke abzunehmen.

Hierdurch war bewiesen, dass die fragliche Bouillon die zum Zustandekommen der Reaktion notwendigen Nitrate in einer das Optimum für die Reaction um ungefähr das Zehnfache übersteigenden Menge enthielt, mithin in einer Menge, die nach dem Ergebniss der S. 31 geschilderten Versuche unter allen Umständen ausreicht, um den Eintritt der Reaction zu verhindern.

Es soll indess damit durchaus nicht behauptet werden, dass eine jede Peptonbouillon, welche trotz ausreichenden Wachsthums der Choleraeinsaat und trotz Nitratreaction den Eintritt der Rothreaction vermissen lässt, gerade an dem erwähnten Fehler leiden muss. So bleibt, wie dies nach den angeführten Salkowski'schen Angaben a priori anzunehmen ist, und wie ich dies durch einfache Versuche bestätigen konnte, die Reaction auch bei Ueberschuss an Nitriten aus.

Es ist ferner wohl denkbar und nach den während meiner Untersuchungen gemachten Erfahrungen wahrscheinlich, dass unter Umständen die zur Reaction gleich nothwendige Indolbildung trotz üppigen Wachsthums verhängnissvollen Schwankungen unterliegt. Ich kann mir wenigstens die Erscheinung in anderer Weise nicht erklären, dass es mir wiederholt nicht gelingen wollte, die Reaction in einer Bouillon hervorzurufen, die, nach Flügge'scher Vorschrift [11] angefertigt, ursprünglich weder Nitrate noch Nitrite enthielt, einen sonst geeigneten Zusatz von Nitraten aber künstlich erhalten hatte; ebenso wenig kann ich es mir auf andere Weise erklären, warum manche Bouillon, die nach Fränkel'scher Vorschrift ursprünglich nitrat- und nitritfrei angefertigt und mit entsprechendem Zusatz von Nitraten versehen worden war, nach der Einsaat die Reaction trotz üppigen Wachsthums erst nach mehrtägigem Aufenthalte im Brütschrank bei 37° C. zeigte, während eine mit der gleichen Cultur besäte nitrathaltige Peptonkochsalzlösung von 2 Procent Peptongehalt hierzu nur einiger Stunden bedurfte. In beiden Fällen glaube ich, eine mangelhafte bezw. verspätete Indolbildung als Ursache vermuthen zu dürfen, sei es in Folge eines Mangels an indolbildenden Substanzen, sei. es in Folge reichlichen Vorhandenseins nicht indolbildender Substanzen, die trotzdem den Choleramikroben ein willkommeneres Angriffsobject bieten, als das Pepton und demgemäss die Umwandlung die Indolbildung verzögern. Dass alkalische Bouillon auch ohne Peptonzusatz den Cholerabakterien einen weit günstigeren Nährboden darbietet, als eine auch mehrprocentige Peptonkochsalzlösung ist eine bekannte Thatsache. Auch ans den eben geschilderten Untersuchungsergebnissen geht hervor, dass ein auch nur ganz geringer Zusatz von Bouillon zu einer 1 procentigen Peptonkochsalzlösung, welche an sich als Nährlösung wenig geeignet ist, genügt, um die Lösung in ein gutes Nährsubstrat zu verwandeln. Weiter diese Verhältnisse aufzuklären, fehlte es mir an Zeit; ich beschränke mich deshalb darauf, auch diese Fehlerquelle als solche hervorzuheben.

Eine weitere Fehlerquelle kann daraus erwachsen, dass bei dem Vorhandensein fertiger Nitrite im Nährsubstrat (bezw. auch in den zur Reaction verwandten Säuren) unter Umständen eine Cholerarothreaction da vorgetäuscht wird, wo es sich nicht um Cholerabakterien, sondern lediglich um indolbildende Bakterien handelt. Der Zufall wollte es, dass ich auch dieser Fehlerquelle in der Praxis begegnete. Wie erwähnt, enthielt die zweite, die Cholerarothreaction gebende Bouillon fertige Nitrite und zwar in solcher Menge, dass eine mit Cholera besäte und die Reaction trotz mehrtägigen Aufenthaltes im Brütschrank wegen Nitrat- (bezw. Nitrit-) Mangel nicht gebende 2 procentige Peptonkochsalzlösung die Reaction im selben Moment gab, als ich sie mit dieser Bouillon überschichtete. Wie zu erwarten und ich mich überzeugte, gaben in dieser Bouillon auch andere indolbildende Bakterien die Rothreaction, vorausgesetzt, dass die letztere angestellt wurde, nachdem bereits genügend Indol gebildet und bevor die vorhandenen Nitrite in Ammoniak übergeführt waren.

Ueber die Herkunft der zur Reaction notwendigen Nitrate liegen, wie erwähnt, Untersuchungen bereits von Petri vor. Bei meinen Unter-suchungen fand ich im Gegensatz zu Petri das benutzte Pepton und Wasser nitrat- und nitritfrei, dagegen enthielt das Kochsalz theils Nitrate, theils Nitrite, und besonders enthielt die Bouillon auch ohne vorherige Zusätze Nitrate bezw. Nitrite; letzteres dann, wenn sie von Fleisch stammte, welches durch mehrere Tage bei Zimmertemperatur gelegen hatte; waren dies letztere auch immer nur Spuren, so bietet sich in den Lager- und Verkaufsräumen der Fleischer Gelegenheit genug zu auch erheblicherer Verunreinigung des Fleisches mit Nitraten oder Nitriten durch Berührung mit gepökelten Waaren.

Alle diese Fehlerquellen lassen sich am einfachsten und sichersten dadurch vermeiden, dass man zu Reactionszwecken nicht die in ihrer wesentlichen Zusammensetzung inconstante Peptonbouillon, sondern ein Nährmedium verwendet, welches lediglich die zum Wachsthum und zur Reaction nöthigen Stoffe (Pepton, Kochsalz, Wasser und Nitrate), diese aber in der für Wachsthum und Reaction gedeihlichen Menge enthält.

Als ein solches den Ansprüchen nach meinen Erfahrungen genügendes Nährmedium empfehle ich folgende Lösung:

Pept. sicc. (Witte) 2,00
Natr. chlorst, purissim. 0,5
Aqu. dest. 100,00
Sol. Kal. nitric. purissim. (0,08:100)
Gutt. XXX—L.

Die Lösung wird gekocht und filtrirt und ist nach ihrer Sterilisation zum Gebrauche fertig. Sie hat ausser ihrer einfachen Herstellungsweise den Vorzug, dass sie die Reaction schon nach 4 bis 6 stündigem Aufenthalte im Brütschrank bei 37° C. deutlich giebt, während Bouillon hierzu in allen von mir untersuchten Fällen mindestens 12 bis 24 Stunden, manchmal auch mehrere Tage Zeit brauchte. Was die zur Hervorrufung der Reaction zu verwendenden Säuren anbetrifft, so halte ich mit Salkowski die Salpetersäure wegen ihres kaum zu vermeidenden und außerordentlich schwankenden Nitritgehaltes für ungeeignet. Besser ist nitritfreie Salzsäure; die besten Reactionen erhielt ich mit nitritfreier Schwefelsäure.

Ich halte es nicht für überflüssig hinzuzufügen, dass bei Verwendung des von mir vorgeschlagenen Nährmediums und bei Verwendung von nitritfreier Salz- bezw. Schwefelsäure die Reaction sich anderen Indolbildnern, wie Koth- und Fäulnissbakterien, gegenüber, wie ich mich überzeugte, auch nach mehrtägigem Aufenthalte der Culturen im Brütschranke bei 37° C. nicht hervorrufen lässt. [12]

Die Ergebnisse der vorstehenden Untersuchungen fasse ich folgendermassen zusammen:

  1. Die für das Zustandekommen der Cholerarothreaction neben Indol notwendigen Nitrite werden durch die Cholerabakterien im Wesentlichen ans den im Nährmedium vorhandenen Nitraten gebildet.
  2. Auch in Peptonkochsalzlösungen, in denen die Nitrate durch die Diphenylaminreaction nicht nachgewiesen werden können, können durch die Cholerabakterien Nitrite gebildet werden, jedoch in so geringer Menge, daß sie allein für das Zustandekommen der Rothreaction ohne Einfluss bleiben.
  3. Schon ein sehr geringer Ueberschuss von Nitraten im Nährmedium über das an sich sehr niedrig liegende Optimum genügt indess, um den Eintritt der Reaction unter dem Einfluss der aus ihnen im Ueberschuss gebildeten Nitrite zu verhindern.
  4. Den gleichen Einfluss übt ein Ueberschuss fertiger Nitrite im Nährboden aus.
  5. Eine weitere Veranlassung zum gänzlichen oder längeren Ausbleiben der Reaction kann unter Umständen eine durch die Zusammensetzung des Nährmediums bedingte mangelhafte, bezw. verzögerte Indolbildung abgeben.
  6. Andererseits kann die Verwendung nitrithaltiger Nährmedien oder Säuren zur Reaction eine Cholerarothreaction vortäuschen.
  7. Der Gehalt der in gewöhnlicher Weise zubereiteten Fleischpeptonbouillon an den zur Reaction notwendigen Stoffen, besonders an Nitraten, ist ein so wenig constanter, dass in Rücksicht auf die daraus entspringenden Fehlerquellen ihre Verwendung als Nährmedium bei Anstellung der Cholerarothreaction zu diagnostischen Zwecken sich nicht empfiehlt.
  8. Reine Peptonkochsalzlösungen, denen die Nitrate in der zur Reaction nothwendigen Menge genau zugemessen worden sind, verdienen deshalb, und weil sie die Reaction in bedeutend kürzerer Zeit geben, den Vorzug.
  9. Zur Anstellung der Reaction sind ausserdem nur nitritfreie Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, zu verwenden.

Nachtrag.

Die S. 112 angegebene Formel zur Herstellung einer die Cholerarothreaction innerhalb 6 Stunden gebenden Nährflüssigkeit setzt die Verwendung eines alkalischen Peptons voraus, welches frei von Nitraten ist oder wenigstens nur so geringe Spuren von Nitraten enthält, dass diese an sich für den Eintritt der Reaction ohne Bedeutung sind.

Wie ich mich nachträglich überzeugte, gehört ein so geringer Nitratgehalt der käuflichen Peptone auch bei den Witte'schen Fabrikaten zu den Ausnahmen. Da aber die Grösse der in der Nährlösung vorhandenen Nitratmengen innerhalb sehr enger Grenzen von sehr wesentlichem Einfluss ist auf die Intensität der Reaction sowohl, wie auf die Zeitdauer, nach welcher die Reaction erfolgreich angestellt werden kann, und da die Anstellung der Cholerarothreaction einen Werth für die Diagnose nur besitzt, wenn der zwischen Einsaat und dem Zeitpunkte, von dem ab man den Eintritt der Reaction gegebenen Falles mit Sicherheit erwarten kann, liegende Zeitraum eine gewisse Dauer nicht überschreitet, so wird man, ehe man ein Peptonfabrikat zur Anstellung der Reaction verwendet, gut thun, diejenige Menge des Nitratzusatzes von vornherein zu ermitteln, welche die intensivste Reaction in kürzester Zeit giebt.

Nach meiner Erfahrung verfährt man dabei am vorteilhaftesten folgendermassen:

Man bereitet von dem fraglichen Pepton mittels nitrat- und nitritfreien, destillirten Wassers eine 2 procentige Lösung, setzt ½ Procent nitrat- und nitritfreien Kochsalzes zu und beschickt mit je 10 ccm dieser Lösung 15 Reagensgläschen. Hierauf fügt man zu dem Inhalte jedes eine besondere Nummer erhaltenden Gläschens eine bestimmte Anzahl Tropfen (von 1 bis 14 Tropfen aufsteigend) einer Lösung von Kalinitrat (0,04 Kalinitrat: 100,0 dest. Wassers); ein Gläschen erhält keinen Zusatz. Nach geschehener Sterilisation wird der Inhalt jedes Gläschens mit je einem Tropfen reiner Choleraaufschwemmung beschickt; alsdann gelangen dieselben auf 24 Stunden in den auf 37° Celsius eingestellten Brütschrank. Hierauf giebt man zu dem Inhalte jedes Gläschens vorsichtig einige Tropfen reiner concentrirter Schwefelsäure, so dass dieselbe sich am Boden ansammelt. Nach einigem (am besten halbstündigem) Zuwarten sieht man eine bleibende und sehr deutliche Abstufung in der Röthung des Inhaltes der einzelnen Gläschen, die lediglich durch die Verschiedenheit des Nitrat-Zusatzes bedingt ist. Da der letztere für jedes Gläschen bekannt ist; so lässt sich auf diese Weise leicht für jedes Fabrikat ein für alle Male ermitteln, wie viel Nitratzusatz zur Erzeugung intensivster Reaction nöthig ist. Wie ich durch zahlreiche Versuche feststellte, entspricht der so ermittelte Nitratzusatz gleichzeitig auch dem Optimum in Bezug auf das Minimum an Zeit, die man zwischen Einsaat und Anstellung der Reaction verstreichen lassen muss, um des Erfolges sicher zu sein. In meinen zahlreichen Versuchen überschritt die hierzu nöthige Zeitdauer auch bei schwächster Einsaat nie 7 Stunden; bei gewöhnlicher Einsaat aus der Plattencolonie konnte ich nach 6 ständigem Aufenthalte der besäten Nährlösung im Brütschrank bei 37° Celsius in jedem Falle auf den Eintritt einer sehr deutlichen Reaction sicher rechnen; bei starker Einsaat bedurfte es in einzelnen Fallen nur 4 Stunden. Immerhin wird es sich empfehlen, von jedem zu verwendenden Peptonfabrikat nachträglich noch besonders zu ermitteln, wie lange die von ihm hergestellte Peptonkochsalzlösung bei günstigstem Nitratzusatz nach der Einsaat bedarf, um die Reaction zu geben, zumal dies sich ja alsdann in einfachster Weise bewerkstelligen lässt.

Fußnoten

  1. Eingeliefert am 18. Februar 1893.
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  2. Fränkel, Deutsche medicinische Wochenschrift. 1892. Nr. 9. S. 925.
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  3. Salkowski, Ueber das Choleraroth. Virchow's Archiv. 1887. Bd. CX. 8. 369.
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  4. Ebenda. S. 372.
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  5. Petri, Reduction von Nitraten durch die Cholerabakterien. Centralbatt für Bakteriologie und Parasitenkunde. 1889. Bd. V. S. 19.
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  6. Salkowski, a. a. O. S. 867.
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  7. Petri, a. a. O. S. 5 u. 7.
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  8. Petri, a. a. O. S. 5.
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  9. Wo in der Folge von nitratfreien Reagentien u.s.w. die Rede ist, gilt dies nur in dem Sinne, dass in ihnen Nitrate durch Diphenylaminsehwefelsäure nicht nachgewiesen werden konnten (vgl. die weiter unten gemachten Bemerkungen über die Schärfe dieser Reaction).
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  10. Wie ich hierzu ausdrücklich bemerke, halte ich es nicht für zulässig, aus dieser auffallenden und constant von mir beobachteten Erscheinung ohne Weiteres den Schluss zu ziehen, dass die in dem Gläschen 2 unter dem Einfluss der Cholerabacillen gebildeten Nitrite, wie dies Salkowski annahm, in der That ein aus dem Pepton abgespaltenes Oxydationsproduct seien. Ich konnte nämlich feststellen, dass die Menge der in solchen Gläschen gebildeten Nitrite schon nach 24 Stunden ihr Maximum erreicht und sich dauernd unter der für die Hervorbringung der Cholerarothreaction nothwendigen Grenze hält, wie daraus hervorgeht, dass die Rothreaction in solchen Gläschen trotz vieltägigen Aufenthaltes derselben im Brutschrank erst eintritt nach Zusatz einer bestimmten und zwar mit Zunahme der Zeitdauer sich nicht etwa vermindernden Menge von Natriumnitrit, und ebenso ausnahmslos eintritt bei vorsichtigem Zusatz von nitrithaltiger Salpetersäure. Ungezwungener erklären sich die angeführten Beobachtungen, wenn man annimmt, dass die Cholerametaphenylendiaminreaction (sit venia verbo!) in Bezug auf den Nachweis von Nitraten eine viel grössere Schärfe besitzt, als die Reaction mit Diphenylaminschwefelsäure, bezw. die Cholerarothreaction. Man wurde hiernach anzunehmen haben, dass auch die zur Verwendung gelangte Peptonkochsalzlösung Nitrate enthielt, allerdings in solchen Spuren, dass sie weder direct durch die Diphenylaminschwefelsäurereaction, noch indirect durch die Cholerarothreaction nachzuweisen waren.
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  11. Beide Vorschriften unterscheiden sich im Wesentlichen dadurch, dass nach der ersten der Pepton- und Kochsalzzusatz, sowie die Neutralisirung erst nach dem Kochen, nach der zweiten beides bereite Tor dem Kochen des Fleischwassers geschient. Es scheint, als ob der durch das Kochen in allen Fällen herbeigeführte Verlust an indolbildenden Substanzen beim Kochen unter saurer Reaction grösser ausfällt und demgemäss der nachträgliche übliche Ersatz durch nur 1 Procent Pepton zur Deckung des entstandenen Verlustes hier nicht ausreicht; in der That gelang es mir, solche Bouillon vorausgesetzt, dass sie einen geeigneten Nitratgehalt besass, durch Erhöhung des Peptonzusatzes reactionsfähig zu machen.
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  12. Analoge Controlversuche mit den Finkler'schen und Deneke'schen Spirillen, die ich wegen Mangels an Culturen erst nach Abgang des Manuscriptes anstellen konnte, führten zu demselben negativen Ergebniss.
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